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      羅氏公司TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)程序點(diǎn)擊次數(shù):3557 更新時(shí)間:2010-01-19

      羅氏公司TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)程序

      貨號(hào):11684817910,In Situ Cell Death Detection Kit, POD,價(jià)格:5266.8

      一、 原理:

      TUNEL(TdT-mediated dUTP nick end labeling)細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒是用來檢測(cè)組織細(xì)胞在凋亡早期過程中細(xì)胞核DNA的斷裂情況。其原理是熒光素(fluorescein)標(biāo)記的dUTP在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶(TdT Enzyme)的作用下,可以連接到凋亡細(xì)胞中斷裂DNA的3’-OH末端,并與連接辣根過氧化酶(HRP,horse-radish peroxidase)的熒光素抗體特異性結(jié)合,后者又與HRP底物二氨基聯(lián)苯胺(DAB)反應(yīng)產(chǎn)生很強(qiáng)的顏色反應(yīng)(呈深棕色),特異準(zhǔn)確地定位正在凋亡的細(xì)胞,因而在光學(xué)顯微鏡下即可觀察凋亡細(xì)胞;由于正常的或正在增殖的細(xì)胞幾乎沒有DNA斷裂,因而沒有3‘-OH形成,很少能夠被染色。本試劑盒適用于組織樣本(石蠟包埋、冰凍和超薄切片)和細(xì)胞樣本(細(xì)胞涂片)在單細(xì)胞水平上的凋亡原位檢測(cè)。還可應(yīng)用于抗腫瘤藥的藥效評(píng)價(jià),以及通過雙色法確定細(xì)胞死亡類型和分化階段。

      二、 器材與試劑

      器材:光學(xué)顯微鏡及其成像系統(tǒng)、小型染色缸、濕盒(塑料飯盒與紗布)、塑料蓋玻片或封口膜、吸管、各種規(guī)格的加樣器及槍頭等;

      試劑:試劑盒含TdT 10×、熒光素標(biāo)記的dUTP 1×、標(biāo)記熒光素抗體的HRP;自備試劑:PBS、雙蒸水、二甲苯、梯度乙醇(100、95、90、80、70%)、DAB工作液(臨用前配制,5 μl 20×DAB+1μL 30%H2O2+94 μl PBS)、Proteinase K工作液(10-20 μg/ml in 10 mM Tris/HCl, pH 7.4-8)或細(xì)胞通透液(0.1% Triton X-100 in 0.1% sodium citrate,臨用前配制)、蘇木素或甲基綠、DNase 1(3000 U/ml– 3 U/ml in 50 mM Tris-HCl,pH 7.5, 10 mM MgCl2,1 mg/ml BSA)等。

      三、 實(shí)驗(yàn)步驟

      操作流程圖:制作石蠟切片→脫蠟、水合→細(xì)胞通透→加TUNEL反應(yīng)液→加converter-POD→與底物DAB反應(yīng)顯色→光學(xué)顯微鏡計(jì)數(shù)并拍照。

      具體操作步驟:

      1. 用二甲苯浸洗2次,每次5min;

      2. 用梯度乙醇(100、95、90、80、70%)各浸洗1次,每次3min;

      3. PBS漂洗2次;

      4. 用Proteinase K工作液處理組織15-30 min 在21–37°C(溫度、時(shí)間、濃度均需摸索)或者加細(xì)胞通透液8min;

      5. PBS漂洗2次;

      6. 制備TUNEL反應(yīng)混合液,處理組用50μl TdT+450μl 熒光素標(biāo)記的dUTP液混勻;而陰性對(duì)照組僅加50μl 熒光素標(biāo)記的dUTP液,陽性對(duì)照組先加入100μl DNase 1,反應(yīng)在15~25℃×10min,后面步驟同處理組。

      7. 玻片干后,加50μl TUNEL反應(yīng)混合液(陰性對(duì)照組僅加50μl 熒光素標(biāo)記的dUTP液)于標(biāo)本上,加蓋玻片或封口膜在暗濕盒中反應(yīng)37℃×1h。

      8. PBS漂洗3次;

      9. 可以加1滴PBS在熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞(激發(fā)光波長為450~500nm,檢測(cè)波長為515~565nm);

      10. 玻片干后加50μl converter-POD于標(biāo)本上,加蓋玻片或封口膜在暗濕盒中反應(yīng)37℃×30min。

      11. PBS漂洗3次;

      12. 在組織處加50~100μlDAB底物,反應(yīng)15~25℃×10min;

      13. PBS漂洗3次;

      14. 拍照后再用蘇木素或甲基綠復(fù)染,幾秒后立即用自來水沖洗。梯度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。

      15. 加一滴PBS或甘油在視野下,用光學(xué)顯微鏡觀察凋亡細(xì)胞(共計(jì)200~500個(gè)細(xì)胞)并拍照。可結(jié)合凋亡細(xì)胞形態(tài)特征來綜合判斷(未染色細(xì)胞變小,胞膜完整但出現(xiàn)發(fā)泡現(xiàn)象,晚期出現(xiàn)凋亡小體,貼壁細(xì)胞出現(xiàn)鄒縮、變圓、脫落;而染色細(xì)胞呈現(xiàn)染色質(zhì)濃縮、邊緣化,核膜裂解,染色質(zhì)分割成塊狀/凋亡小體)

      四、 注意事項(xiàng)

      1. 進(jìn)行PBS 清洗時(shí),每次清洗5 min。

      2. PBS清洗后,為了各種反應(yīng)的有效進(jìn)行,請(qǐng)盡量除去PBS 溶液后再進(jìn)行下一步反應(yīng)。

      3. 在載玻片上的樣本上加上實(shí)驗(yàn)用反應(yīng)液后,請(qǐng)蓋上蓋玻片或保鮮膜,或在濕盒中進(jìn)行,這樣可以使反應(yīng)液均勻分布于樣本整體,又可以防止反應(yīng)液干燥造成實(shí)驗(yàn)失敗。

      4. TUNEL反應(yīng)液臨用前配制,短時(shí)間在冰上保存。不宜長期保存,長期保存會(huì)導(dǎo)酶活性的失活。

      5. 如果20×DAB 溶液顏色變深成為紫色,則不可使用,需重新配制。

      6. 用甲基綠(Methyl Green)染液(3-5%甲基綠溶于0.1M 醋酸巴比妥 PH4.0)染色后,請(qǐng)用滅菌蒸餾水清洗多余的甲基綠。然后進(jìn)行洗凈(100%乙醇)、脫水(二甲苯)透明、封片后通過光學(xué)顯微鏡觀察操作。如果此時(shí)使用80~90%的乙醇洗凈時(shí),甲基綠比較容易脫色,注意快速進(jìn)行脫水操作。

      7. 熒光素標(biāo)記的dUTP液含甲次砷酸鹽和二氯鈷等致癌物,可通過吸入、口服等途徑進(jìn)入機(jī)體,注意防護(hù)。

      8. 試劑保存;未打開的試劑盒貯存在-20℃(-15~25℃);converter -POD液一旦解凍,以后就保存在4℃(2~8℃)下,至少在6 m內(nèi)穩(wěn)定,避免再次凍存;TUNEL反應(yīng)液臨用前配好后,放至冰上直至使用。

      9. 結(jié)果分析時(shí)注意:在壞死的晚期階段或在高度增殖/代謝的組織細(xì)胞中可產(chǎn)生大量DNA片斷,從而引起假陽性結(jié)果;而有些類型的凋亡性細(xì)胞死亡缺乏DNA斷裂或DNA裂解不*,以及細(xì)胞外的矩陣成分阻止TdT進(jìn)入胞內(nèi)反應(yīng),進(jìn)而產(chǎn)生假陰性結(jié)果。

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