技術文章

      分析影響ELISA中非特異性顯色的原因點擊次數:2350 更新時間:2009-11-13

             影響ELISA中非特異性顯色的原因很多,如試劑盒特異性、檢驗標本中含酶標記物的干擾物,操作過程中的問題。本文就這一原因作一簡要分析,以便可以通過以上措施把非特異顯色降至zui低限度,從而提高檢測的特異性,并得到更準確、可靠的實驗結果。
      1、試劑盒特異性因素
      1、1 固相載體的選擇。ELISA中常用的固相載體有微量滴定板、小珠和小試管三種,以微量滴定板zui為常見[1]。它具有良好的吸附性能,孔底透明度高,空白值低,各板之間、同一板各孔之間性能相近。聚苯乙烯ELISA板由于原料的不同和制作工藝的差別,各產品的質量差異很大。因此,在選擇試劑盒同時要對其使用的微孔板型號進行認證,評估。
      1、2包被物的純度。在酶聯免疫測定尤其是間接ELISA中,試劑的特異性取決于使用抗原的純度。目前由于技術條件的限制,包被用抗原或抗體的純度不可能達到100%,所以有些非特異性顯色不可避免,只能盡可能提高純度,提高特異性。目前使用的包被抗原一般為合成多肽抗原。
      1、3包被抗體的效價。具有高親和力和高特異性的包被抗體,是決定試劑特異性的重要方面。
      1、4 封閉。是ELISA中重要的一步,目的是封閉固相載體表面尚未被所占據的空隙[2],減少后續步驟中非特異性蛋白的干擾。
      2、檢驗標本中含有酶標記物的干擾物
      2、1內源性干擾物:類風濕因子(RF)、黃疸等,類風濕因子是可作用于多種動物以及人IgGFc段的自身抗體,多數為IgM類,能充當抗原成分與固相及酶標抗體反應,從而呈現非特異性顯色。
      黃疸血標本中常含有內源性過氧化物酶,如用辣根過氧化物酶為標記物,就有可能產生非特異性顯色。
      2、2 外源性干擾物,常常因樣品采集、貯存、處理不當造成如樣品溶血,被細菌污染,標本凝集不全等。溶血標本,紅細胞溶解破裂,釋放出血紅素形成,而血紅素中的鐵卟啉是過氧化物酶的類似物,以HRP為標記的ELISA測定中,溶血標本可能會增加非特異性顯色。如有細菌污染,菌體中可能含有內源性HRP(辣根過氧化酶)[2],有國內報道酶免HBsAg試劑檢測溶血標本時可造成假陽性[3]。如在冰箱中保存過久,其中的IgG可發生聚合,在間接法ELISA中可使本底加深[2]。因此,血標本在采集處理時應小心,在冰箱中保存不易過久。
      標本凝集不全時,血清中會殘留部分纖維蛋白原,也易造成假陽性。
      3、操作過程中的問題造成假陽性
      3、1加樣
      對于間接ELISA標本一般都要進行稀釋,如果加樣不準就會造成誤差,尤其當稀釋倍數大時,很小的誤差,會導致較大的相對誤差,使陰性(或弱陽性)標本呈陽性(或陰性)。加樣時應將所加物加在ELISA板孔的底部,避免加在孔壁上部,并注意不可濺出,不可產生氣泡。目前,大部分血站都已使用全自動酶免加樣系統處理標本,可較好地避免以上誤差。
      3、2洗滌
      在ELISA中正確的洗滌是保證得到可重復結果的關健一步,應引起操作者重視。無論是手工操作還是機器操作,得出不正確的結果常與不正確的洗滌有關,ELISA就是靠洗滌來達到分離游離和結合的酶標記物的目的。通過洗滌以消除殘留在板孔中沒能與固體抗原或抗體結合的物質,以及在反應過程中非特異性吸附于固相載體的干擾物質。
      3、3 溫育
      每種試劑都有其*反應模式,其中溫度和溫育時間控制是重要因素。因孵育溫度高,反應時間長,會造成整板本底高,陽性率高。溫育一般用濕盒或水浴,反應板不宜疊放,以保證各板溫度都能迅速平衡,為避免蒸發,板上應加蓋。
      3、4酶標儀判讀
      作為記錄測定結果的儀器,酶標儀的性能穩定與否,決定結果的可靠度。首先酶標儀應定期進行保養,對濾光片要定期校正;其次酶標儀波長設置要正確,使用雙波長,一個檢測波長,一個參比波長,以消除微孔板底部劃痕、不平、指印或液面高度差異造成的光干擾。此外,在用酶標儀讀數時先擦試微孔板底部并壓平板條。由于各種酶標儀性能有所不同,使用中應詳細閱讀說明書
      綜上所述,由于酶聯免疫吸附技術目前在技術上缺乏標準化,盡管目前上以及我國有了部分標準血清或參比血清(血清盤)。但由于受方法學及技術條件的限制,在酶聯吸附測定中有時不可避免的會出現一定的非特異性,但我們可以通過以上措施把非特異性顯色降至zui低限底,從而提高檢測的特異性,并得到更準確、可靠的實驗結果。
      電話:
      13788993509
      13788995069
      021-64133189
      傳真:
      021-64129208
      陳小姐點擊這里給我發消息
      徐小姐點擊這里給我發消息
      朱小姐點擊這里給我發消息
       
      安全聯盟站長平臺

      化工儀器網

      推薦收藏該企業網站
      主站蜘蛛池模板: 神马伦理电影看我不卡| 91学院派女神| 樱花视频www| 免费在线观看污网站| 黑人大长吊大战中国人妻| 大陆三级特黄在线播放| 久久中文字幕网站篠田优| 欧美成人午夜影院| 免费看AV毛片一区二区三区| 香蕉视频黄色在线观看| 国产精品资源站| xxxx性视频| 日本三人交xxx69| 亚洲欧洲国产视频| 精品免费视频一卡2卡三卡4卡不卡| 国产成人av乱码在线观看| 97精品伊人久久久大香线蕉| 把美女日出白浆| 五月天婷婷精品视频| 欧美视频在线播放观看免费福利资源| 四虎成人精品在永久在线| 成年人免费的视频| 国产美女久久久| swag在线播放| 无码aⅴ精品一区二区三区| 亚洲av中文无码乱人伦| 污视频网站在线| 免费日本黄色片| 老司机亚洲精品影视www| 国产天堂在线观看| 动漫卡通精品3d一区二区| 亚洲色欲或者高潮影院| 久久精品无码一区二区三区免费 | 日日碰狠狠添天天爽爽爽| 美腿丝袜亚洲综合| 阿娇与冠希13分钟视频未删减| 精品视频香蕉尹人在线| 特级深夜a级毛片免费观看| 欧美色欧美亚洲高清在线观看| 国产∨亚洲v天堂无码久久久| 国产网站麻豆精品视频|